變性梯度凝膠電泳(DGGE)原理

如果 DNA 雙鏈分子全長不斷增加溫度或用化學變性劑處理,兩條鏈就會開始分開(解鏈)。**先解鏈的區域由解鏈溫度較低的堿基組成。 G.C 堿基對比 A.T 堿基對結合得要牢固,因此 G. C 含量高的區域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力(稱作“堆積”)。解鏈溫度低的區域,通常位於端部稱作低溫解鏈區( lower melting domain )。如果端部分開,那麽雙螺旋就由未解鏈部分束在一起,這一區域便稱作高溫解鏈( high melting domain ) 。如果溫度或變性劑濃度繼續升高,兩條鏈就會完全分開。變性梯度凝膠電泳法依據**要的一點是: DNA 雙鏈末端一旦解鏈,其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降。第二個根據是,如果某一區域**先解鏈,而與其僅有一個堿基之差的另一條鏈就會有不同的解鏈溫度,因此,將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二者分開。**終,如果一雙鏈在其低溫解鏈區堿基錯配(異源雙鏈),而與另一等同的雙鏈相比差別僅在於此,那麽,含有錯配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實上,樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對的異源雙鏈,後者是在 PCR 擴增加時產行的。而含有錯配的雙鏈通常可以遠遠地與兩個同源雙鏈分開,這種分離效果使該方法靈敏度很高。
  為使僅有一個堿基之差的不同分子取得**好的分離效果,**先選擇所要研究的 DNA 範圍以及電泳樣品時變性劑濃度梯度。這可以正交變性梯度實驗進行經驗性的解決。變性劑梯度應選在曲線斜率大的部分,因為這時多數分子處於部分變性狀態這使得落入低溫解鏈區的不同分子達到**佳分離。
  為防止對患者樣品分析之前對目標 DNA 片段的經驗性分析占去大量時間,已在本技術的改進人 Leonard Lerman 的實驗室設計了一項計算機程序,程度名叫 MELT87 和 SQHTX ,它可以模擬和任何已知序列 DNA 解鏈溫度有關的解鏈行為。以堿基序列為基礎,程序可以給出解鏈圖象。作為實例血紅蛋白基因的解鏈圖。程序還可給出**佳凝膠電泳時間以及任何堿基改變對解鏈圖象產生的預期影響。 MELT87 程序還可以決定是否將多聚 GC 加到 3’ 或 5’ 端的引物上。
  現在多數分析是用所謂的“ GC 夾板”( clamp )技術進行的(見下文)。它是將一段長度為 30-50 堿基,富含 GC 的 DNA 附加到雙鏈的一端以形成一個人工高溫解鏈區。 這樣,片段的其他部分就處在低溫解鏈區從而可以對其進分析。這一技術使該方法可檢測的突變比例大大增加。