表達蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

一、原理
細菌體中含有大量蛋白質,具有不同的電荷和分子量。強陰離子去汙劑SDS與某一還原劑並用,通過加熱使蛋白質解
離,大量的SDS結合蛋白質,使其帶相同密度的負電荷,在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上,不同蛋白質的遷移率僅
取決於分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色,可及時觀察電泳分離效果。因而根據預計表達蛋白的分子量,可篩選陽性
表達的重組體。
二、試劑準備
1、30%儲備膠溶液:丙烯酰胺(Acr)29.0g,亞甲雙丙烯酰胺(Bis)1.0g,混勻後加ddH2O,37OC溶解,定容**100ml, 棕
色瓶存於室溫。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0):Tris 18.17g加ddH2O溶解, 濃鹽酸調pH**8.0,定容**100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8):Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 濃鹽酸調pH**6.8,定容**100ml。
4、10% SDS:電泳級SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,濃鹽酸調**pH 7.2,定容**100ml。
5、10′電泳緩衝液(pH 8.3):Tris 3.02 g,甘氨酸 18.8 g,10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容**100ml。
6、10%過硫酸銨(AP): 1gAP加ddH2O**10ml。
7、2′SDS電泳上樣緩衝液:1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml,b-巰基乙醇1.0ml,SDS 0.6 g,甘油 2.0ml,0.1%溴酚蘭 1.0ml,
ddH2O 3.5ml。
8、考馬斯亮蘭染色液:考馬斯亮蘭 0.25 g,甲醇225ml,冰醋酸 46ml,ddH2O 225ml。
9、脫色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配製而成。
三、操作步驟
采用垂直式電泳槽裝置
(一)聚丙烯酰胺凝膠的配製
1、 分離膠(10%)的配製:
ddH2O 4.0ml
30%儲備膠 3.3ml
1.5M Tris-HCl 2.5ml
10% SDS 0.1ml
10% AP 0.1ml
取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,餘加TEMED 4μl ,混勻後灌入玻璃板間,以水封
頂,注意使液麵平。(凝膠完全聚合需30-60min)
2、 積層膠(4%)的配製:
ddH2O 1.4 ml
30%儲備膠 0.33 ml
1M Tris-HCl 0.25 ml
10%SDS 0.02 ml
10%AP 0.02 ml
TEMED 2 μl
將分離膠上的水倒去,加入上述混合液,立即將梳子插入玻璃板間,完全聚合需15-30min。
(二)樣品處理:將樣品加入等量的2×SDS上樣緩衝液,100℃加熱3-5min,離心12000g×1min,取上清作SDS-PAGE分
析,同時將SDS低分子量蛋白標準品作平行處理。
(三)上樣: 取10μl誘導與未誘導的處理後的樣品加入樣品池中,並加入20μl低分子量蛋白標準品作對照。
(三) 電泳:在電泳槽中加入1′電泳緩衝液,連接電源,負極在上,正極在下,電泳時,積層膠電壓60V,分離膠電壓
100V,電泳**溴酚蘭行**電泳槽下端停止(約需3hr)。
(四) 染色:將膠從玻璃板中取出,考馬斯亮蘭染色液染色,煮沸1min。
(五) 脫色:將膠從染色液中取出,放入脫色液中,煮沸1min,搖床脫色**蛋白帶清晰。
(六) 凝膠攝像和保存:在圖像處理係統下將脫色好的凝膠攝像,結果存於軟盤中,凝膠可保存於雙蒸水中或7%乙酸
溶液中。
四、注意事項
1、實驗組與對照組所加總蛋白含量要相等。
2、為達到較好的凝膠聚合效果,緩衝液的pH值要準確,10%AP在一周內使用。室溫較低時,TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經毒性,可通過皮膚和呼吸道吸收,應注意防護。