毛細管電泳的應用前景

一, 毛細管電泳的興起與發展

    毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE),又稱高效毛細管電泳(HPCE)是近年來發展**快的分析化學研究**域之一.1981年Jorgenson等[1]在75μm內徑的毛細管內用高電壓進行分離,創立了現代毛細管電泳.1984年Terabe等[2]發展了毛細管膠束電動色譜(MECC).1987年比Hjerten[3]建立了毛細管等電聚焦(CIEF),Cohen和Karger[4]提出了毛細管凝膠電泳(CGF).1988—1989年出現了**批CE商品儀器,1989年**屆**際毛細管電泳會議召開,標誌了一門新的分支學科的產生.短短的幾年內,由於CE符合了以生物工程為代表的生命科學各**域中對生物大分子(肽,蛋白,DNA等)的高度分離分析的要求,得到了迅速發展,正逐步成為生命科學及其它學科實驗室中一種常用的分析手段.近三年來**際毛細管電泳會議與會者均達700—800人,1996,1997兩年公開發表的有關CE論文達3600餘篇.可參見相關綜述則[5-8].歐洲,美****內及日本也相繼召開CE地區性**際會議.我**在CE**域研究起步早,發展快,研究工作較全麵,有的研究成果達到**際先進水平.定期召開全**CE會議及亞太地區**際會議,在**際上已有一定的影響.1984年中**科學院化學所竺安教授在**內率先開展CE研究,迄今**內已有幾百個單位開展CE研究和應用.從CE理論到各種模式及各方麵應用,**內均在進行.1998年舉行的第三屆全**CE會議共收錄論文129篇,同時舉行的第二屆亞太**際會議也取得了成功.毛細管電色譜(CEC),CE/MS聯用,低背景毛細管梯度凝膠電泳,手性藥物分離,逆流聚焦及脫氧核糖核酸(DNA)各種CE測定方法等一批研究成果均達到**際先進水平.

二, 毛細管電泳基本原理

    CE是以高壓電場為驅動力.以毛細管為分離通道,依據樣品中各組成之間淌度和分配行為上的差異,而實現分離的一類液相分離技術.儀器裝置包括高壓電源,毛細管,柱上檢測器和供毛細管兩端插入又和電源相連的兩個緩衝液貯瓶,在電解質溶液中,帶電粒子在電場作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象稱電泳.CE所用的石英毛細管在PH>3時,其內液麵帶負電,和溶液接觸形成一雙電層.在高電壓作用下,雙電層中的水合陽離子層引起溶液在毛細管內整體向負極流動,形成電滲液.帶電粒子在毛細管內電解質溶液中的遷移速度等於電泳和電滲流(EOF)二者的矢量和.帶正電荷粒子**先流出;中性粒子的電泳速度為"零",故其遷移速度相當於EOF速度;帶負電荷粒子運動方向與EOF方向相反,因EOF速度一般大於電泳速度,故它將在中性粒子之後流出;各種粒子因遷移速度不同而實現分離,這就是毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)的分離原理.CZE的遷移時間t可用下式表示:
式中,μep為電泳淌度,μen為電滲淌度,V為外加電壓,ιt為毛細管總長度,ιd為進樣到檢測器間毛紉管長度.理論塔板數N為:
式中,D為擴散係數.分離度R為<BR>式中,μ1,μ2分別為二溶質的電泳淌度,μep為二溶質的平均電泳淌度.
從式(11.2)可看出,CE的N是和溶質的擴散係數D成反比,而高效液相色譜 (HPLC)的N和D成正比,因此擴散係數小的生物大分子,CE的柱效比HPLC高得多.CE比HPLC有更高的分離能力,主要由兩個因素決定:一是CE在進樣端和檢測時均沒有像HP比的死體積;二是CE用電滲流作推動流體前進的驅動力,整個流體呈扁平型的塞式流,使溶質區帶在毛細管內不易擴散,而HPLC用壓力驅動使柱中流體呈拋物線型,導致溶質區帶擴散,使校效下降
    CE將經典電泳技術和現代微柱分離有機地結合,取得了比HPLC和平板凝膠電泳更多的優點.概括起來可謂三高二少一廣.高質量靈敏度:常用紫外檢測器檢測限可達10-13一10-15mol,激光誘導熒光檢測器(LIF)則達10-19一10-21mol.高分辨率:每米理論塔板數為幾十萬,高者可達幾百萬乃**幾千萬.高速度:許多分析可在幾十秒內完成.所需樣品少:隻需納升(10-9)的進樣量.成本低:隻需少量的流動相和低廉的毛細管.應用範圍廣;除分離生物大分子外,還可用於小分了(氨基酸,藥物等)及離子(無機及有機離子).甚**可分離各種顆粒(如細胞,矽膠顆粒等).
    CE發展迅速也得力於大批色譜工作者轉向CE,在理論上提出了各種模型,如解釋CZE中區帶擴展及理論塔板高度模型,熱影響模型,遷移速率和分離度模型等等[9-10].近年來基礎研究集中於解決CE應用中一些**性問題.如EOF對分離,定量影響極大,故研究了測弱EOF的方法,陽離於存在下的EOF,還有在兩個中性標記物之間夾一個緩衝液塞的三明治式方法測定EOF [11].EOF測定將解決CE定量問題.電泳淌度定量計算也在發展,如用金屬陽離子的一些結構參數,定量得出結構—保留(電泳)間的關係(QSRR) [12]及計算手性化合物淌度的軟件等.特別是各種優化方法用於優化CZE,MECC,CEC及手性分離的實驗參數,如重疊分離譜(OBM),多變量統計設計及Plackett-Buman多變量實驗設計[13]等.

三, 毛細管電泳分離模式

    按毛細管內分離介質和分離原理的不同,CE現有六種分離模式,分述如後.
1. 毛細管區帶電泳(CZE)
    CZE分離機理是基於各被分離物質的淨電荷與其質量比(荷質比)間的差異.迄今CZE仍是應用**多的模式,應用範圍包括氨基酸,肽,蛋白,離子,對映體拆分和很多其它帶電物質的分離.CZE常用介質為電解質水溶液,根據情況可加入不同有機溶劑或其它添加劑.還有一種非水CE,如在乙腈中加入嗡 鹽(tropyltum)來分離多環芳烴化合物,現在發展到可不加支持電解質,直接用乙腈,甲酰胺,甲醇等作溶劑來進行非水CE[14].
毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)
    CGE是將平板電泳的凝膠移到毛細管中作支持物進行電泳,不同體積的溶質分子在起"分子篩"作用的凝膠中得以分離.常用於蛋白質,寡聚核苷酸,核糖核酸(RNA),DNA片段分離和測序及聚合酶鏈反應(PCR)產物分析.CGE能達到CE中**高的柱效.為了解決人類基因組計劃的**,即DNA測序的速度,已試製出96支毛細管陣列的DNA測序儀,並已有8支毛細管陣列的DNA測序商品儀器.凝膠的製備和不同模式令人關注,**近發展出—種低背景毛細管梯度凝膠電泳[15],在測定糖,寡聚核苷酸及人工模擬蛋白方麵取得進展.還有報道采用親和凝膠電泳來識別和鑒定基於DNA藥物的結合蛋白等.
3. 毛細管膠束電動色譜(mfcellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)
    采用表麵活性劑(如十二烷基硫酸鈉,SDS)在運動緩衝液內形成一疏水內核,外部帶負電的動態膠束相,利用溶質具有不同的疏水性,因而在水相和膠束相(準麵定相)間分配的差異進行分離,既能分離中性溶質又能分離帶電組分的CE模式.MECC拓寬了CE的應用範圍,主要用於小分子,中性化合物,手性對映體和藥物等.常用表麵活性劑有各種陰離子表麵活性刑,陽離子表麵活性劑,非離子和兩性表麵活性劑.也有用混合膠束,如陰離子表麵活性劑和膽酸鹽組合混合膠束.有報道采用脂肪醇的微乳液膠束電動色譜(MEEKC)有比MECC更高的柱效,更快的分析速度和容易控製"窗口" [16].ag娱乐app也成功地用MEEKC同時分離測定酸性和堿性蛋白.
4. 毛細管等電聚焦(capillary isoelelectric focusing,CIEF)<BR>用兩性電解質在毛細管內建立pH梯度,使各種具有不    同等電點的蛋白質在電場作
用下遷移到等電點的位置,形成窄的聚焦區帶.已成功地用於測定蛋白質等電點,分離<BR>異構體等.如用CZE和CIEF研究製備過程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,<BR>結果表明CIEF方法要比CZE的好[17].
5. 毛細管等速電泳(capillary isotachophoresis,CTTP)<BR>采用先導電解質和尾隨電解質.使溶質按其電泳淌度不同得    以分離,是一種較老的方式.現在常用作柱前濃縮方法用以富集樣品,以解決CE測定中濃度靈敏度不如服比的問題,如HPLC的問題,如在線ITP—CZE即是成功的模式[18].
6. 毛細管電色譜(capillary electrochromatography,CEC)
    將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細管中(或塗漬到管壁).以樣品與固定相之間的相互作用為分離機製,以電滲流為流動相驅動力的色譜過程稱為CEC[19-20]. CEC將CE的高效和HPLC的高選擇性相結合,得到了CE研究者的青睞.90年代初解決了毛細管填充技術後,CEC發展迅速,HPCE'97會議上已達35篇論文,HPCE'98又創54篇之多.CEC可分為開管CEC(即管壁塗漬固定相)和填充CEC.我**學者在CEC方麵作了大量研究工作,對CEC的理論,反相電色譜,正相電色譜,離子交換電色譜及電色譜手性分離等模式均作了較係統研究[21-23],連續兩年在**際CE會上作大會報告,目前已在ODS,矽膠,氰基,胺基,陰,陽離子交換樹脂等10餘種填料CEC柱上進行研究,開管CEC也發展了一些新技術,如矽膠—溶膠法在管壁塗漬C8固定相[24],分子印刷法分離手性化合物[25].
    以上六種模式為CE基本模式,此外如親和,**毛細管電泳發展趨勢亦較好.

四,毛細管電泳柱技術

    毛細管是CE的核心部件之一.早期研究集中在毛細管直徑,長度,形狀和材料方麵,目前集中在管壁的改性和各種柱的製備.
1. 動態修飾毛細管內壁
    管壁改性主要是消除吸附和控製電滲流,通常采用動態修飾和表麵塗層兩類方法.動態修飾采用在運行緩衝液中加入添加劑,如加入陽離子表麵活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB),能在內壁形成物理吸附層,使EOF反向.添加劑還有聚胺,聚乙烯亞胺(PEI)等,甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層.
2. 毛細管內壁表麵塗層
    塗層方法有很多種,包括物理塗布,化學鍵合及交聯等 **常用的方法是采用雙官能團的偶聯劑,如各種有機矽烷,**個官能團(如甲氧基)與管壁上的遊離羥基進行反應,使其與管壁進行共價結合,再用第二個官能團(如乙烯基)與塗漬物(如聚丙烯酰胺)進行反應,形成一穩定的塗層.此外還有將纖維素,PEI和聚醚組成多層塗層,親水性的絨毛塗層(fuzzy)和聯鎖聚醚塗層[6].
3. 凝膠柱和無膠篩分
   CGE的**是毛細管凝膠柱的製備,常用聚丙烯酰胺凝膠栓來進行DNA片段分析和測序.測定蛋白質和肽的分子量常用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-LPAGE).如將聚丙烯配胺單體溶液中的交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)濃度降為零,得到線性非交聯的親水性聚合物用作操作溶液,仍有按分子大小分離的作用,稱無膠篩分.此法簡單,使用方便,分離能力比CGE差.
4. 毛細曾填充往等
    CEC填充柱已在前麵論述.也有將核糖核酸酶,己糖激酶,腺苷脫氨酶等固定到
毛細管表麵,構成一開管反應器,再和CE連接,可進行核酸選擇性檢測,微量在線合成和分離寡核昔酸等工作.另一有意義的工作是用各種方式在毛細管內緩衝液中形成各種梯度,如PH梯度,溶劑濃度梯度等,來提高分離效率和選擇性.

五, 毛細管電泳檢測技術

     CE對檢測器靈敏度要求相當高,故檢測是CE中的**問題.迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜末用於CE外,其它檢測手段均已用於CE.現選擇重要的幾類檢測器介紹其**新進展.
1. 紫外檢測器(UV)
    UV檢測器集中在提高靈敏度,如采用平麵積分檢測池,這種設計可使檢測光路增加到1cm[26].也有用光散射二極管(LEDS)作光源,其線性範圍和信噪比優於汞燈.總體來說進展不大.
2. 激光誘導熒光檢測[LIF]
    LIF是CE**靈敏的檢測器之一,極大地拓展了CE的應用,DNA測序就須用LIF,單細胞和單分子檢測也離不開LIF.LIF不但提高了靈敏度,也可增加選擇性,缺點在於被測物須用熒光試劑標記成染色.利用CE-LIF技術可檢出染色的單個DNA分子,向癌症的早期診斷及臨床酶和**學檢測等方向進行.CE/LIF向三個方向發展:在原有氦—鎘激光器(325nm)和氬離子激光器(488nm)之外,發展價廉,長波長的二極管激光器;發展更多的熒光標記試劑來擴展應用麵;開展更多的應用研究.CE/I'IF和微透析結合可測定腦中神經肽.采用波長分辨熒光檢測器可提供有關蛋白和DNA序列的一些結構和動態信息[27].一些適用於二極管激光器的熒光標記試劑如CY—5等,正在不斷開發和應用.
3. CE/MS聯用
    將現在**有力的分離手段CE和能提供組分結構信息的質譜聯用,彌補了CE定性鑒定的不足,故發展特別快.CE/MS聯用主要在兩方麵發展:一是各種CE模式和MS聯用,二是CE和各種MS聯用.**是解決接口裝置.成功地應用到CE/MS接口中.